低成本高速度——一種新型高速三維隨機(jī)讀取顯微鏡

在生物研究領(lǐng)域，要深入理解細(xì)胞和深層組織中的生物活動(dòng)，高速三維成像技術(shù)是不可或缺的工具[1-3]。傳統(tǒng)的共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）因其出色的光學(xué)切片能力，廣泛應(yīng)用于厚樣本的生物成像研究[4, 5]。然而，由于CLSM通過(guò)逐點(diǎn)掃描構(gòu)建圖像，獲取三維圖像需要對(duì)多個(gè)光學(xué)切片逐層掃描，導(dǎo)致時(shí)間成本較高，難以滿足三維動(dòng)態(tài)生物事件研究對(duì)高時(shí)間分辨率的需求。

為應(yīng)對(duì)這一挑戰(zhàn)，三維隨機(jī)讀�。╮andom-access）顯微鏡應(yīng)運(yùn)而生，提供了高速三維動(dòng)態(tài)成像的有效工具，推動(dòng)了相關(guān)研究領(lǐng)域的發(fā)展[6, 7]。但現(xiàn)有的三維隨機(jī)讀取顯微成像方案通常存在結(jié)構(gòu)復(fù)雜、成本高昂以及缺乏多色成像能力等局限性，限制了其在生物學(xué)研究中的廣泛應(yīng)用。

2024年11月11日，深圳灣實(shí)驗(yàn)室侯尚國(guó)團(tuán)隊(duì)聯(lián)合上海交通大學(xué)仲冬平團(tuán)隊(duì)、南昌大學(xué)鄧素輝團(tuán)隊(duì)，在Nature旗下期刊Communications Engineering上發(fā)表了題為“Three-dimensional random-access confocal microscopy with 3D remote focusing system”的研究論文。研究團(tuán)隊(duì)提出了一種新型的具有遠(yuǎn)程聚焦系統(tǒng)的三維隨機(jī)讀取共聚焦顯微成像技術(shù)（3D-DyFI）。相比傳統(tǒng)的三維隨機(jī)讀取成像方法，該技術(shù)在保持空間分辨率的同時(shí)，將軸向響應(yīng)時(shí)間提升了34倍，實(shí)現(xiàn)了高達(dá)500 Hz的成像刷新率。研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)熒光微球、活細(xì)胞成像及不同位置熒光珠的監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了3D-DyFI技術(shù)的有效性。該技術(shù)有望為細(xì)胞生物學(xué)、神經(jīng)科學(xué)及疾病研究提供更加快速、精準(zhǔn)的成像手段。并且該論文被選錄于“Microscopic Imaging in Deep Tissue”專輯。

 

1.系統(tǒng)設(shè)計(jì)

3D-DyFI系統(tǒng)采用635 nm、561 nm和488 nm激光作為激發(fā)光源，支持多色成像。如圖1a所示，激光經(jīng)消色差雙合透鏡擴(kuò)束后進(jìn)入三維動(dòng)態(tài)聚焦系統(tǒng)（3D Galvo），該系統(tǒng)由兩個(gè)正交振鏡和一對(duì)平凹透鏡組成，可精確控制激光焦點(diǎn)在三維空間中的位置。激光經(jīng)掃描筒鏡進(jìn)入物鏡，有效減少因振鏡掃描帶來(lái)的場(chǎng)畸變和像差。熒光信號(hào)經(jīng)物鏡收集，并通過(guò)三維動(dòng)態(tài)聚焦系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)去掃描，最后由雪崩光電二極管（APD）檢測(cè)記錄。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，3D-DyFI的成像點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)（PSF）與傳統(tǒng)壓電平臺(tái)相當(dāng)（圖1b-c），驗(yàn)證了其高空間分辨率。圖1d-f進(jìn)一步表明系統(tǒng)在x、y、z軸的電壓與焦點(diǎn)位置呈線性關(guān)系，證明了系統(tǒng)對(duì)激光焦點(diǎn)的精準(zhǔn)控制和穩(wěn)定性。

圖1. 3D-DyFI系統(tǒng)的原理示意圖、點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)和線性表征