醫(yī)用顯微鏡是對微小物體，如人體組織、細胞、血球以及細菌、病毒等進行觀測和分析的光學儀器。一個生物體放大1000倍后，就可以進行組織（組織學）和細胞（細胞學）以及病理（病理學）的診斷和研究。 :W(3<D7\
標準的光學顯微鏡通常由目鏡和物鏡兩個部分組成光學系統(tǒng)，主要是凹凸透鏡的組合使用。物體經(jīng)目鏡和物鏡二次放大，所以顯微鏡的放大率是目鏡和物鏡放大率的乘積。同時，通過光路計算可得出，顯微鏡的鏡筒愈長，目鏡與物鏡的焦距愈短，放大率就愈大。 P/sn zm|@
顯微鏡的另一個重要特性是分辨能力，分辨率是由物鏡的數(shù)值孔徑（NA）決定的，NA一般為0.65，最大為1.5~1.6。數(shù)值孔徑越大，分辨能力就越高。 . [DCL
但是，顯微鏡能夠獲得的最高放大倍數(shù)是受到可見光的波長限制的。因為可見光的波長范圍是從400到700 nm（0.4~0.7 μm），所以能夠分辨的最小物體約為1 μm直徑。由于大多數(shù)細胞的直徑是5~50 μm，因此，光學顯微鏡是適合于分辨大于亞細胞的所有物體。并且，通過光學技術(shù)的組合運用，光學顯微鏡的最高分辨率可以提高到0.2 μm左右。一般地說，提高物鏡的分辨率有兩種方法：一種是把物鏡浸在油或水里，來增加其數(shù)值孔徑，另一種是利用波長短的光，如紫外線，可把分辨率提高一倍。 O 4@sN =o
在光學顯微鏡的光學操作中，使用三個基本原理：反射、折射和衍射。 Z_Jprp{3h
1. 相襯顯微鏡技術(shù)——因為大多數(shù)細胞對于所有波長的可見光是透明的（除了血紅細胞以外），所以薄的組織切片在顯微鏡下是看不到什么的。為了分辨不同的細胞，通常需要用強烈吸收某些波長可見光的化學品（如染料）把它們?nèi)旧�，不同的化學品用于染不同的細胞成分，從而得以幫助辨認細胞的結(jié)構(gòu)。但是，染色的程序相當繁雜，并且有時會傷害有機體的生命力。 .r[b!o^VR
有一種光學技術(shù)是利用細胞不同部分的不同折射率。因為光在細胞的不同部分以不同的速度傳播，所以光波的相位關(guān)系在經(jīng)過樣品時就會改變，相襯顯微鏡就利用了這個折射現(xiàn)象使細胞結(jié)構(gòu)得以見到而不用染色。這類顯微鏡主要是在直射光的會聚點處增加一塊透明的平行平面板，來增加板像的襯度，以便分辨。實用上是采取方形、十字形、環(huán)形的相板，而環(huán)形相板用得最多。它是在平行平面板上鍍覆一層或多層氧化鎂或冰晶石（氟化鋁和氟化鈉）薄膜制成。 e \x=4i
所謂相襯是通過平行平面板的結(jié)構(gòu)，使穿過組織的光束與導向某一光學上一致區(qū)域的參考光束接合在一起，這個組合光束相互干涉，從而在相消干涉的地方產(chǎn)生黑暗區(qū)域，而在相長干涉的地方產(chǎn)生明亮區(qū)域。這與水面上一個油點所看到的彩色圓環(huán)是一樣的基本原理。 |3{DlZ2S
2.熒光顯微鏡技術(shù)——熒光顯微鏡是一種對于能發(fā)出熒光的物質(zhì)或經(jīng)熒光色素染色后能發(fā)出熒光的物質(zhì)進行觀察的顯微鏡。熒光顯微鏡的光源是紫外光或藍紫單色光。組織樣品是用染料染色的，這種染料被紫外線輻照激發(fā)時會發(fā)出熒光，然后通過適當?shù)臑V光片，就能觀察到幾乎所有的有機分子。 CAyV# 7[0
某些熒光染料對鑒別細胞的類型是有用的，例如，有一類叫做嗜酸性細胞的白血細胞，就是因為它接受一種曙紅的熒光染料，而被觀察到。有時候，用于熒光顯微鏡的細胞染色可以在活體內(nèi)完成。例如，當一個病人被給予四環(huán)素后，它的一部分就混合到新生長的骨中，在新的骨生長部位采取樣品，把它放入熒光顯微鏡時，就會發(fā)出黃色或橙色的熒光。 B5h-JON]-
熒光顯微鏡使用的紫外光源是水銀弧光燈，位于顯微鏡附屬的屏蔽盒中，紫外光順著觀察者的視線直接落在經(jīng)過染色處理的樣品上，從而激發(fā)出熒光，突出組織或細胞的結(jié)構(gòu)或異常的特性，看到在一般照明下看不到的圖像。 s$`g%H>
3.消除色差的透鏡技術(shù)——在可見光譜中，紅光有最長的波長，并且與可見光譜另一端的紫光相比，不太容易散射。顯微鏡的光源發(fā)射具有在紅與紫之間所有波長（即所有顏色）的連續(xù)光譜，每個波長都會以不同程度的折射和反射，并到達稍微不同的焦點上。這個現(xiàn)象叫做色差，在高倍放大時非常明顯。 D|m6gP;P
圖像經(jīng)歷色差后，具有難以確定的邊界。發(fā)生顏色或亮度變化的任何邊界，會被由光束沿邊緣衍射而引起的紅和藍線所突出。對此問題有兩個解決辦法。 <AB N/nH
用于制造顯微鏡所用透鏡的光學玻璃是不可能完全一致的，而且透鏡的涂復也有不同的變化。因此，第一個解決辦法是采用復消色差的透鏡，復消色差透鏡有一層涂覆，以消除由于衍射而引起的波陣面的分離，從而不會顯現(xiàn)出像彩虹那樣的邊緣，但費用較大。第二個校正色差的方法是使用校正透鏡。即，如果彎曲的透鏡前面在光束中引起失真，那么一個相反的彎曲透鏡就能夠部分地恢復光束。光學顯微鏡的最簡單的透鏡由安裝在鏡筒中的單玻璃片組成，以方便操作。而大多數(shù)透鏡由多個玻璃片組成，安排在鏡筒中，以在提供組合放大的同時校正色彩。這與焦點到樣品的距離無關(guān)。 E6a$c`H @?
4.低能X線技術(shù)——有時候在顯微鏡中使用X線技術(shù)是有利的，這種用于顯微鏡檢查的低能X線技術(shù)，叫做組織射線照相術(shù)。X線集束穿過與細粒膠片緊密接觸的組織樣品，而合成的X線影像則在傳統(tǒng)的顯微鏡下考察。因為低能X線可被重分子（如鈣之類）強烈吸收，所以組織射線照相術(shù)常常用于研究已切成薄片（~ 0.1 mm）的骨樣品。 Jv1igA21_h
5.藍色玻璃濾片技術(shù)——在顯微鏡光源和樣品之間的某些點上，可設(shè)計彩色濾片以校正由光源發(fā)射的色譜。因為所有的燈不可能是完全一致的，按照維恩位移律，由熱物體發(fā)射的光譜是直接與物體的溫度有關(guān)的，相對地冷的物體，像電爐加熱元件，在約1700K時發(fā)出暗紅光；而熱的物體，像鎢燈絲在3000K時發(fā)出幾乎是白色的紫光，而直接對它看是難受的。 ''Fy]CwH(
當物體的溫度增加時，最大的波長（即紅色）向光譜的紫色端轉(zhuǎn)移，導致“較白”的光。在較低的溫度時，燈絲可以發(fā)射某些藍色和紫色的波長。然而，此光譜仍然含有足夠的“溫暖”顏色，以給出圖像的一個紅色或橙色的色調(diào)。藍色濾片就可以阻擋更長的“溫暖”顏色，足夠來產(chǎn)生在所有強度水平上的“白”光，以便清晰地觀察組織樣品。 g*C&Pr3
6.提高放大倍率的波長選擇技術(shù)——在光學顯微鏡上，2000倍的放大率，一般地被認為是對于具有標準光學零件的傳統(tǒng)光學顯微鏡的放大率的絕對限度。大多數(shù)具有油透鏡的光學顯微鏡停留在1600倍上，就是在這一點，或者衍射變成過分地難以聚焦一個圖象，或者使用可見光來看則結(jié)構(gòu)太小。為了能夠觀察，在檢視下的樣品特征必須大于所使用的光的波長。例如，如果考慮一個550納米（綠光）的中等波長，那么容易觀察到具有75000納米（或75微米）的血紅細胞。最小的細菌在500納米時顯現(xiàn)為模糊的陰影，而較大的樣品在10000納米則可清晰地分辨。在50納米大小的病毒是難以探測的，光線環(huán)繞在病毒周圍，因為光的波長太大而被微粒吸收。這與無線電波不能被電話桿阻擋但可被建筑物阻擋的道理是一樣的。但是，視頻圖像的計算機處理能夠展示人們在正常情況下不能看到的美妙事物。 cnr&%-
7.暗場與偏振光技術(shù)——在白光下，物鏡最多能分辨0.2 μm，若照明光束不直接射入物鏡，則視場呈黑暗狀態(tài)，通過目鏡就可以觀察到0.1μm甚至更小的超顯微粒子（如某些病毒）。這類暗場顯微鏡一般采用側(cè)向照明或落射光側(cè)向照明。 +;~JHx.~X
偏光顯微鏡主要是增加了兩個偏光鏡，利用光的偏振特性對具有雙折射性的物質(zhì)進行精細結(jié)構(gòu)的觀察，如齒、骨、頭發(fā)、指甲、卵巢、活細胞的結(jié)晶內(nèi)含物、神經(jīng)纖維、肌肉等。又因在旋光性方面，正常細胞對偏振光左旋，而腫瘤細胞對偏振光右旋，所以還可進行癌癥的鑒別。
